生化試劑應用常見問題的探討

試劑空白吸光度是反映試劑質量的指標之一，但不能反映試劑質量的全部。試劑成份、純度、用量及穩定性，才是保證試劑質量的關鍵所在。目前市售的一些試劑具有抗干擾作用，主要是通過加入抗干擾物質或使用新的色素原以避免內源性物質的干擾。但值得注意的是：一些試驗項目在消除內源性物質干擾的同時，會帶來樣品含量真實性的變化。
1 試劑空白
試劑空白吸光度是反映試劑質量的指標之一。每種試劑都有一定的空白吸光度范圍，試劑空白吸光度的改變往往提示該試劑的變質；如利用Trinder反應為原理的檢測試劑會因含酚類物質被氧化為醌而變為紅色。堿性磷酸酶、r一谷氨酰轉肽酶、淀粉酶等檢測試劑會因基質分解出硝基酚或酚基苯胺而變黃。有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶等負反應，在放置過程中其試劑空白吸光度會因NADH自行氧化為NAD+而下降。原則上，吸光度上升的反應，其試劑空白吸光度越低越好，不能超過一個高限；相反，吸光度下降的反應，其試劑空白吸光度不能低于一個低限。因此，試劑空白吸光度限值，常作為程序參數輸入儀器，如經核查超限，儀器會自動報警，提示更換試劑。需要指出的是，還原型輔酶I（或II）等投料量不足或劣質的原料，往往需要加大用量，才使“表觀”吸光度上升，湊合過試劑空白核對的“關”，其后果為如下情況：
1．1 線性范圍變窄 現象：高值測不高。原因：生產試劑時有效成分投料量不足；試劑成份穩定性較差。
1．2 靈敏度變低現象：酶促反應速度曲線斜率下降，測定結果有嚴重系統誤差。原因：試劑底物濃度不足。
1．3 低值偏高 現象：試劑空白的變化曲線（吸光度VS時間）明顯波動。原因：試劑自身不穩定，自行分解；工具酶純度
不夠，雜酶含量超限，導致干擾作用。
2 樣品信息
樣品的溶血、脂血、黃疸等會對測定結果產生非化學反應的干擾。因此，應根據溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，采用雙波長或多波長的檢測模式，并在結果計算中扣除因溶血、脂血、黃疸引起的影響，減少干擾程度。
3 測定范圍
每種待測物都有一個可測定的濃度或活性范圍，樣品結果若超過此范圍，分析儀將顯示結果超過范圍的提示。表示試劑已經變質，應更換合格試劑。
4 底物耗盡
使用連續監測法、兩點法測定酶活性時，若酶活性非常高，底物接近被耗盡，吸光度上升或下降會超過某一吸光度變化范圍，監測期的吸光度將偏離線性，使測定結果不可靠。
5 酶的預活化
測定血清中的某些酶，如CK，離體（采血）后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巰基（一SH）被氧化造成的。只有通過適當的還原作用才能重新激活。如CK—NAC試劑盒即含有CK活化劑，名為N一乙酰半胱氨酸。實驗研究證明，NAC對血清中已失活的CK活化過程約需180 S。這就是CK測定為什么要延遲時間較長的理論依據。在AST，ALT采用IFCC推薦方法測定時需要磷酸吡哆醛預活化。需要強調：含有活化劑的生化試劑，其測定酶活性的結果要高些。
6 校準與結果溯源性
酶的校正：要滿足在同一方法學、同一測定條件、與理論計算的FACTOR值差異不大，沒有發現有明顯影響因素，方可
進行校正。
檢驗結果溯源性，得建立一個可靠的參考系統作為準確性基礎，然后將準確性轉移到常規方法測定中去，使常規方法測定結果可溯源到參考系統所提供的準確性基礎上來。在實現溯源性目標過程中，永遠以患者新鮮標本為實驗對象，以方法學對比試驗方法為驗證手段。方法學對比試驗常采用回歸方程進行統計分析，假如斜率接近1，截距較小，這意味著實驗室常規方法對標本測定結果和溯源目標參考系統對標本檢測結果非常接近。
臨床化學中參考標準（二級標準）要有通用性，但生產廠家提供的校準液并非通用的，只適用于某一特定的分析系統。
校準液標示值往往是按其基質偏差修正的，所以標示值并非實際值。校準液、質控血清通常是經過處理的混合人或動物血清，這種制備物在特定分析系統中往往與人新鮮血清反應性不同而產生基質偏差。如總膽固醇測定基質效應研究指出：校準液酶法測定回收結果偏低可達5%~7%。
7 試劑抗干擾作用的合理性有些液體雙試劑，其實質并不真正具備抗干擾的能力而只是解決了試劑的液體化和穩定性問題。如，ALT試劑盒中，NADH在pH7.5~7.8水溶液中極不穩定，在pH>8.7時才能穩定保存。因此，為了保證試劑穩定性，液體雙試劑的R1需要維持pH>8.7，但此時LDH活性大大下降，就失去消除內源性丙酮酸的功能，只有加入試劑R2后，反應混合液的pH下降至LDHzui適pH，在經過延遲時間60 S后，才能消除內源性丙酮酸的干擾。再如，Tfinder反應中抗Vc干擾問題：由于維生素c易氧化，樣品中Vc會競爭反應生成的過氧化氫，而產生負干擾。因此，在試劑R1中加入抗壞血酸氧化酶，這種方法是有效的，但不一定有很大的意義。因為Vc干擾必須同時具備二個條件：a）Vc攝入量較多；b）采血后立即測定。實驗表明離體血清中Vc在90 min后會全部被氧化。又如，使用胺類新色原。a）分子共軛結構特性使得靈敏度提高，相應可以減少樣本用量，zui終能有效地降低干擾物的量．b）使生成胺類色素原zui大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上，以避開黃疸、溶血干擾。如：亞鐵氰化鉀一H 0 ，能有效避免黃疸干擾的理論依據是亞鐵氰化鉀與H。0。親和力遠遠大于膽紅素。
甘油三酯測定，有人主張選用雙試劑方法消除內源性甘油，這個方法是可行的，但忽視了一個化學平衡理論。因為所有的酯在水溶液中都不是簡單地以酯的形式存在，而是以水解與酯化相平衡的形式存在。在一個平衡體系中，如果去除游離甘油，這個平衡就向生成甘油方向移動，甘油三酯就會重新水解，生成新的甘油，達到新的平衡，因此樣品與R1試劑孵育時間越長，測得甘油三酯值就越低。甘油三酯測定，不僅要去除游離甘油，而且還要克服樣本含量真實性發生的變化，試劑中必須加入甘油激酶，并且延遲時間要標準化。所以，一些試驗項目在消除內源性物質干擾的同時，會帶來樣品含量真實性的變化。